本學期實驗課的孔雀魚系列之五 - 雄魚橘斑面積與雌性選擇有關嗎？

在上一次的實驗中，同學們檢測了不同種的花鱂(包含兩個近緣種，與一個親緣關係較遠物種)在配對時的行為反應。當然由那樣的實驗來佐證生殖器型態的差異就是造成三種兩性個體間反應的差異或生殖隔離是言之過早的，因為與種間辨識、配偶選擇與生殖隔離有關聯的特質(trait)不會只有一個。這也就是說除了生殖器型態差異之外，一定還有其它的因素。

早在1978年與1980年發表的兩篇論文中，John Endler報導產在千里達溪流中的野生孔雀魚雄性體色的鮮豔程度與掠食壓力之間具有明顯的關連性。在諸多探索雄魚體色醒目程度(conspicuousness)與雌性選擇關係的研究中也顯示雌魚的確會偏好體色亮麗的雄魚。

馬里蘭大學的Anne Houde在1987年的時候使用三個指標，也就是「單一雄魚與處女雌魚相遇到交配所花費的時間」、「處女雌魚對經過身旁但並未求偶的雄魚回應的頻度」、「雌魚回應雄魚展示行為的相對頻度」來檢測雌魚對不同大小雄魚橘斑的反應。

Houde當年在實驗中使用了來自千里達的Paria河野生個體的第二與第三子代，但是現實上我們很難直接拿到野生個體的第二或第三子代，因此我們直接採用水族貿易中流通的個體。反正只要橘色斑面積與醒目程度在雄魚個體間有差異就行了。

Houde當年怎麼做實驗的呢？根據那篇論文，她使用如下幾個指標來判斷雌魚是否對雄魚有反應：(1) 她遇到雄魚以後就停下手邊的工作 (例如看到帥雄魚就不吃飼料了)；(2) 會尾隨雄魚，癡癡地跟人家走，而且頭也不回；(3) 遇到自己的菜就整個「滑過去」，和平常的泳姿完全不同。

好，以上這三個行為只是雌性發現雄魚是她的菜的行為指標，實際上Houde做了三個實驗收集數據。

• 交配速度：求偶行為到交配成功的時間長短被視為衡量雄性的性吸引力的方式。她把雄魚依據不同橘斑大小分成四個等級(分別為A、B、C與D)。每隻雄魚的「第一次展示到成功交尾時間」與「在成功交配前的展示次數」會被記錄下來。
• 雌魚對沒有展示行為雄魚的反應：雌性在15分鐘內繞過雄魚的次數(是一個頻率)。
• 雌魚對有展示行為雄魚的反應：雌性在20分鐘內對展示雄魚的有回應而且最後交配的次數。

Houde收集了這些數據後，先做出橘斑面積佔身體比例的分布圖(histogram)，然後再把雌魚的反應分級，最後再統計檢測橘斑所佔面積與雌魚反應的關聯性。

那麼我們要怎麼做呢？Houde的實驗設計比較麻煩，所以我們不要這樣做。我要你們這樣做：

• 一組給你兩雌六雄
• 六隻雄性分別與雌性配對，一次配對至少15min。
• 每一次配對時，都要記錄：
  (1) 雌性停下原來動作，游到雄魚邊的時間 T1
  (2) 雌性持續停在該雄魚旁邊的時間T2
  (3) 雌魚在20min內繞過雄魚的次數N1
  (4) 雌魚與雄魚保持近距離接觸的時間T3
  (5) 最後是否有交配成功 (Y or N)
• 假設你有六雄兩雌，表示你們最多可以進行12次的配對(雌性可互換)，然後如果有那一次配對成功(有交配)，那隻雌性就不必再使用。
• 每一隻魚都有自己的編號
• 拍攝每一隻雄魚，並測量其橘斑面積與身體面積的比例 (%)
• 把所有數據以這個表單的格式填寫，然後開放給同學抓取。填寫完畢之後所有同學應該可以看到所有組別的數據，這樣大家就可以根據48隻(或42隻)雄魚的數據，製作出X軸為橘色比例，以及Y軸為隻數的圖。助教根據大家數據分布，再決定我們要把雄魚的橘色比例區隔為幾個等級，並加以編號。
• 我們使用Spearman's係數來檢測橘斑面積等級與以上行為之間究竟是正相關？負相關？還是無相關？
• 數據繳交與整併：在實驗結束後次日晚間10點前在Line上面上傳本次實驗所錄製影片的頻道短網址，與google資料夾短網址，而該資料夾應該要包含以下資訊：
  (1) 所有雄魚的照片 (應該被編輯過)，檔名就是那條魚的編號
  (2) 數據紀錄的Excel檔案
• 報告繳交：周六晚間10點前，以線上文件書寫，擺在同一個線上資料夾裏 
• 相關論文可由此處下載：https://tinyurl.com/ybkd8hxm 

本學期實驗課的孔雀魚系列之四 - 如何檢測種間生殖隔離的機制？

一般的基礎生物學、演化生物學、演化生態學課本在提到「物種生成」(speciation)與「物種觀」(species concept)的時候一定會提到「生殖隔離」(reproductive isolation)這的概念。雖然課本上提到生殖隔離的時候經常提到這是恩斯特·瓦爾特·邁爾(Ernst Mayr)在1942年所提出的「生物物種觀」(Biological Species Concept，簡稱BSC)的基礎。然而生殖隔離事實上已由費奧多西·多布然斯基(Theodosius Dobzhansky)在1930年代末期提出來。

課本上所提到的生殖隔離通常區分為「合子形成前」(prezygotic)與「合子形成後」(postzygotic)兩群機制。而在合子形成前的隔離機制方面，「機械性」(mechanic)與「行為性」(behavioral)隔離最容易被肉眼所觀察。而機械性生殖隔離還由「鎖鑰假說」(Lock-and-Key Hypothesis)所支持。

所謂的鎖鑰理論其實是一個很早就被提出來的構想。法國的昆蟲學家雷翁杜富(Leon Dufour)在1841年時發現可以使用生殖器來區辨物種(根據當時的物種觀)。這樣的發現不僅限於昆蟲，也在爬行動物以及哺乳動物中被發現。Dufour在1844年宣稱「每個物種的雄性都發展出來一套獨特的複雜生殖器官，用於匹配該物種的雌雄生殖器官」，也就是說「雄性需要發展出一枚能夠打開雌雄生殖器大門的鑰匙」。

這個理論從1844年至今已有長期的歷史，然而由於我們對兩性生殖動物的生殖器功能並不完全清楚，因此這個理論並不那麼容易檢驗。此外在一些仰賴婚飛或集體求偶交配的動物上，高度的生殖器個體變異也可能讓這個理論的預測失準。

不過在花鱂科(Poecilidae)魚類的生殖、婚配與性擇演化議題上，雄性交尾器(gonopodium)的尖端形態經常被視為「種間辨識」(interspecific recognition)與機械性生殖隔離的佐證。如果你使用Poecilidae、gonopodium和reproductive這類的字眼在資料庫或google中搜尋，你一定可以找到非常多的研究議題，例如「生殖器形態與其它身體部位能量投資的權衡得失」、「近緣種的交尾器差異」以及「生殖器型態與雌性選擇偏好的關聯性」。雖然這些研究的操作都不算很困難，不是技術門檻很高的研究，但因為要瞭解性擇偏好所代來後果所需要的實驗時間較長，而且所需要的動物數量與空間也大，因此我打算讓同學做一個非常非常簡化的實驗，也就是讓各位使用「親緣關係遠近不同的花鱂」進行同種與異種配對。由於花鱂亞科的魚類為胎生魚，因此同學可以輕易觀察到兩性之間的互動與是否完成交配。

我打算讓各位使用一般孔雀魚(Poecilia reticulata)與近緣的恩德勒孔雀魚(=安德拉斯孔雀魚)(Poecilia wingei)，加上親緣關係稍遠的黑純胎生鱂(Girardinus metallicus)進行這個實驗。首先我們需要瞭解孔雀魚、恩德勒孔雀魚以及黑唇胎生鱂三個物種分別的求偶行為(可以參考這個說明)，這樣你才能理解你究竟看到了什麼。在實驗流程中同學需要以手機錄下雌雄之間的互動行為，然後再交換性別與物種來比較同種異性與異種異性個體之間的互動究竟有什麼樣的差異。我們將進行以下 9個配對，且讓每個組合進行2個重複：

• A處理 - Poecilia reticulata male x Poecilia reticulata female
• B處理 - Poecilia wingei male x Poecilia wingei female
• C處理 - Girardinus metallicus male x Girardinus metallicus female
• D處理 - Poecilia reticulata male x Poecilia wingei female
• E處理 - Poecilia reticulata male x Girardinus metallicus female
• F處理 - Poecilia wingei male x Poecilia reticulata female
• G處理 - Poecilia wingei male x Girardinus metallicus female
• H處理 - Girardinus metallicus male x Poecilia reticulata female
• I處理 - Girardinus metallicus male x Poecilia wingei female

每一隻魚都不能被重覆使用。例如A處理中的雄性孔雀魚就不能在D處理中使用，這是因為在這個實驗中我們要確保每一隻受測個體的先前經驗與次數相同，以免影響先前經驗影響後續行為。

那麼各位要觀察與記載什麼？

• 假設你分配到A處理，那麼你就需要有兩對魚，包含兩隻一般孔雀魚雄魚和兩隻孔雀魚雌魚。首先你要把水族箱中的隔離板打開，打開後就要開始錄影，記錄魚的互動。若展現求偶行為，交配了，或是完全沒反應，等再久都沒有反應，就表示一輪實驗結束。
• 記載你被分配到的組合的雌雄之間的互動情形，以手機清楚錄下行為，分析雄性是否對雌性展現求偶行為？雌性是否接受雄性求偶？最後有沒有交配成功？
• 有展現或有接受記載為YES，沒展現或不接受記載為NO，交尾成功記載為YES，沒有交尾記載為NO。
• 把編輯與標記過的影片上傳到youtube，將短網址與與觀察結果填入這個表單，匯集全班的實驗數據以後，全班就使用一模一樣的數據進行以下的分析。

要分析與檢測什麼？

• 「雌雄是否同種」與「雄性是否展現求偶行為」是否有關聯性？
• 「雌雄是否同種」與「雌性是否接受雄性求偶」是否有關聯性？
• 「雌雄是否同種」與「是否成功交配」是否有關聯性？
• 我們應該會使用費雪精確檢定，詳細操作將在課堂上解說。

檢測完以後，你可以嘗試回答以下提問：

• 若交配成功與否與是否同種有關，就表示某種型式的生殖隔離發揮作用嗎？
• 若雄性對雌性求偶，雌性不接受，就表示有生殖隔離嗎？
• 若雄性對雌性求偶，雌性接受了，就表示沒有生殖隔離嗎？

實驗做完要怎麼辦？

• 交配過的雄魚(要同一種)可集中管理
• 交配過的每一隻雌魚(要標記配對雄魚是那一種那一隻)要隔離飼養
• 沒有交配、沒有展現任何求偶、接受或拒絕行為的魚便回到原飼養缸中繼續飼養。